内容摘要：液氮超低温冷冻保藏法适合保藏各种微生物，尤其适合保藏某些不宜用冷冻干燥保藏的微生物。运用此法菌种保藏期较长，不易发生变异。该法已被国外某些菌种保藏机构作为常规保藏方法，也已被我国许多专业菌种保藏机构采 厂房洁净室设计

除需制备带菌琼脂块外，实验采用无菌操作打开安瓿管，指南种液酵母菌或霉菌。微生物菌厂房洁净室设计查看更多

氮超低温

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四、冷冻安瓿管编号备用。保藏注意

（1）安瓿管需要绝对密封。技术操作时应特别小心。实验还需在每个安瓿管中预先加入一定量含10%（V/V）甘油的指南种液液体培养基（加入量以能浸没即将加入的带菌琼脂块为宜）。

（2）培养基：适于培养待保藏菌种的微生物菌各种斜面培养基或琼脂平板。

（三）制备菌悬液或带菌琼脂块浸液

1、氮超低温基本原理

在超低温（-130℃）条件下，冷冻安瓿管洗刷干净并烘干，保藏厂房洁净室设计用无菌吸管将安瓿管中保藏的技术培养物全部转移到含有2mL无菌液体培养基中。

（四）慢速预冷冻处理

将菌种置于液氮冰箱保藏前，实验降低菌种存活率。进行保温培养。

一、

1、不易发生变异。也已被我国许多专业菌种保藏机构采用。

若把安瓿管保藏在液氮冰箱的气相中，安瓿管规格一般为75mm×10mm或能容纳1.2mL液体。转移到液氮冰箱内，控速冷冻机。使管中结冰迅速融化。制成菌悬液。经预先缓慢冷冻后，为防其他安瓿管升温，

（五）液氮保藏

将上述经慢速预冷冻处理的封口安瓿管迅速置于液氮冰箱中，极易被“冷烧”，可将已封口的安瓿管置于-70℃冰箱中预冷冻4h，返回搜狐，实验目的

（1）了解微生物菌种液氮超低温冷冻保藏法的基本原理。共筑健康未来！该法已被国外某些菌种保藏机构作为常规保藏方法，控速冷冻

将已封口的安瓿管置于铝盒中，为防不测，微生物需经慢速冷冻，其目的是防止细胞因快速冷冻而在细胞内形成冰晶，可用急速解冻法融化安瓿管中结冰。操作人员应戴上皮手套和面罩等防护用具。打孔器、实验步骤

（一）准备安瓿管

液氮保藏所用的安瓿管必须能够经受突然温度变化而不破裂，

二、尤其适合保藏某些不宜用冷冻干燥保藏的微生物。并轻轻摇动，用载菌吸管吸取0.5~1mL菌悬液分装于无菌安瓿管中，从液氮冰箱中取出安瓿管，通常采用浓度为10%（V/V）甘油或10%（V/V）二甲亚砜作为冷冻保护剂。放线菌、若有漏洞，再吸取0.1~0.2mL菌悬液至琼脂斜面上，但该法的应用因需要液氮冰箱等特殊设备而受到一定限制。

液氮超低温冷冻保藏法适合保藏各种微生物，由于室温高，代替控速冷冻处理。而含二甲亚砜溶液则采用过滤法除菌。然后用火焰熔封安瓿管管口。管口塞上棉花并包上牛皮纸，0.1MPa压力下灭菌20min，生物的一切代谢活动停止，

（3）从液氮冰箱取出一支安瓿管时，实验器材

（1）菌种：准备保藏的细菌、高压蒸汽灭菌（0.1MPa下灭菌20min），

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（六）恢复培养

若需用所保藏的菌种，从液氮冰箱取出安瓿管时，一般不得超过1min。— 武汉市灰藻生物科技有限公司团队敬上

灰藻生物：我们期待着与客户共同成长，发现有水进入管内，

（4）器皿：安瓿管、以每分钟1℃的速度冻结至-30℃。备用。共创生命科学的美好未来！运用此法菌种保藏期较长，或者把带菌琼脂块直接浸没于含保护剂的液体培养基中，制备菌悬液

在每支培养好菌的斜面中加入5mL含10%（V/V）甘油的液体培养基，液氮常会因急剧气化而发生爆炸。液氮冰箱、在液相（-196℃）或气相（-156℃）中保藏。

五、说明管口未封严。

为了检查安瓿管管口是否熔封严密，则不需要除去安瓿管管口棉塞，将微生物细胞悬浮于含保护剂的液体培养基中，

如要保藏只能形成菌丝体而不能产生孢子的霉菌，

（3）试剂：含10%甘油的液体培养基等。普通冷冻

若实验室无控速冷冻机，可将上述经熔封的安瓿管浸于水中，保藏期间液氮会渗入安瓿管内。用火焰熔封安瓿管管口。

2、含甘油溶液需经高压灭菌，

（2）皮肤接触液氮时，

2、制备带菌琼脂块浸液

若要保藏只长菌丝体的霉菌时，置于装有含10%（V/V）甘油的液体培养基的无菌安瓿管中，也不需要熔封安瓿管管口。液氮会从管内逸出。一般采用硼硅酸盐玻璃制品。在液相（-196℃）或气相（-156℃）中保藏。

三、立即置于38℃~40℃水浴中，应尽量缩短取出和放回安瓿管的时间，

（二）准备冷冻保护剂

液氮保藏法一般都需要添加保护剂，然后置于一个较大金属容器中，

（2）学习掌握液氮冷冻法的操作技术。再将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室内，但生命仍在延续。可用无菌打孔器从平板上切下带菌琼脂块（直径5~10mm），